HPLC同步测定秃疮花中紫堇丁碱同分异构体的含量（二） 流动相为甲醇-水洗脱体系

2.2 定量分析方法

采用HPLC(1525-2707 TCM-2489色谱系统）、同步秃疮同分体柱型C18(250 mm×4.6 mm,测定5μm），流动相为甲醇-水洗脱体系，花中含量洗脱方法为：0～5 min用10%甲醇-水体系溶液平衡柱子，紫堇5～35 min由10%甲醇水溶液过渡到100%甲醇体系，丁碱进行10%甲醇-100%甲醇体系梯度洗脱，异构45～48 min由100%甲醇过渡为10%甲醇-水体系，同步秃疮同分体48～50 min用10%甲醇-水体系平衡柱子。测定上样量1 m L，花中含量进样体积10μL，紫堇每个样品运行检测时间为50min，丁碱柱温30℃，异构检测波长260 nm。同步秃疮同分体

2.3 醇提物和单体化合物的测定保留时间与峰值

图1为10 g/m L秃疮花乙醇提取液HPLC分析色谱图，横轴是花中含量保留时间（单位是min），纵轴是电信号（单位是Au）。在保留时间22 min时有高强度色谱峰。图2为同一条件下紫堇丁碱和异紫堇丁碱的色谱图，其保留时间与秃疮花醇提物一致。

2.4 含量分析

单体化合物的含量计算方法：设单体化合物的浓度梯度，经HPLC分析，建立积分面积与浓度之间关系的回归方程、线性关系和保留时间（见图5和表3）；将醇提物中该物质在某一浓度（如10 mg/m L）下的峰面积（y）代入回归方程，计算出该物质的质量浓度x(mg/m L）；将x带入物质的含量计算公式，可得该单体化合物在原材料中的含量（注：根据前期试验，提取率按照平均为17%进行计算）。秃疮花中紫堇丁碱含量为0.79%、异紫堇丁碱含量为1.33%。

3 讨论

利用峰面积与单体化合物浓度之间线性回归方程和物质的含量计算公式，计算出单体化合物在各自原材料中的含量。异紫堇丁碱占酸化氯仿相的48.9%，紫堇丁碱占酸化氯仿相的19.7%，两者合计共占酸化氯仿相的68.6%；建立积分面积与浓度之间关系的回归方程，紫堇丁碱y=16 369 907.7x-393 024.811(R2=0.999 872 719），秃疮花中紫堇丁碱含量为0.79%；异紫堇丁碱y=13 281 438.44x-36 671.693 15(R2=0.999 834 091），秃疮花中异紫堇丁碱含量为1.33%。

4 结论

建立秃疮花中紫堇丁碱和异紫堇丁碱的同步提取分离制备方法，采用HPLC研究药用植物秃疮花中分离得到的同分异构体在植物中的含量，并与粗提物保留时间对比定位，检验试验工艺的可行性，初步建立HPLC同时测定生物碱的检测方法。为进一步研究秃疮花的药理活性和构效关系提供试验数据，为药食同源植物中单体化合物含量的定量测定奠定试验基础和理论依据。

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